产品目录

本制品表达、纯化获得的一种DNA模板依赖的DNA聚合酶，可以在单链DNA模板和与其配对的引物存在的条件下，催化5'→3'方向的DNA合成。E.coli DNA Polymerase I同时还具备双链DNA缺刻(nick)处特异性的5'→3'外切酶活性、单链特异性的3'→5'外切酶活性以及核糖核酸酶H活性。E.coli DNA Polymerase I的DNA合成酶活性和双链DNA缺刻(nick)处特异性的5'→3'外切酶活性，可以实现缺刻处3'-OH起始的DNA合成和5'端单链DNA的降解，实现缺口平移。E.coli DNA Polymerase I的单链特异性的3'→5'外切酶活性可以起到DNA合成的校验作用(proofreading)。在有dNTP存在的情况下，E.coli DNA Polymerase I更多地表现为DNA聚合酶活性；而当dNTP不存在的情况下，E.coli DNA Polymerase I更多表现为单链特异性的外切酶活性，例如可以表现为平末端双链DNA中的任一条链的5'端的5'→3'外切酶活性。

• 以双链DNA中的缺刻或缺口为起点合成新的DNA链。
  
• 从缺口处降解与模板链互补的DNA链，实现DNA的缺口平移。
  
• 保证DNA复制过程中错配的校对，并对复制和修复中出现的空隙进行填补。

DNA合成；双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平；双链DNA 3'突出末端(3'overhang)的削平；cDNA第二条链合成；与DNase I一起使用，进行DNA切口平移；DNA的切口翻译以获得具有高比活性的探针。


纯化自携带编码E.coli DNA Polymerase I基因的E.coli重组菌株。


一个单位定义为在37℃条件下，30分钟内将10nmol dNTP掺入酸不溶性物所需的酶量。

组分	250U	1000U	5000U
E.coli DNA Polymerase I(10U/μL)	25μL	100μL	500μL
10×Reaction Buffer	100μL	400μL	2mL

保存：-20℃，有效期2年。


25mM Tris-HCl，1mM DTT，0.1mM EDTA，50% Glycerol，pH7.4@25℃。


10×Reaction Buffer：
100mM Tris-HCl，500mM NaCl，100mM MgCl₂，10mM DTT，pH7.9@25℃。


不含除E.coli DNA Polymerase I之外的其它种类的DNA外切酶，不含内切酶，不含RNase。


75℃孵育20分钟可使E.coli DNA Polymerase I失活。

• 由于E.coli DNA Polymerase I具有外切酶活性，在进行反应前应尽量避免环境温度偏高导致的DNA链被切除。
  
• E.coli DNA Polymerase I不具有内切酶活性，且本制品不包含DNase I，进行切口翻译反应时必须另外添加DNase I。
  
• 对E.coli DNA Polymerase I剧烈震荡或搅拌会使酶失活。
  
• E.coli DNA Polymerase I与DNA的亲和力较高，加入过量的酶易发生凝集作用(Aggregation)，影响反应的进行。
  
• E.coli DNA Polymerase I可使用带修饰的核苷酸(例如生物素、地高辛、荧光标记核苷酸)作为DNA合成的底物，以用于DNA探针的标记。
  
• 酶使用时宜存放在冰盒内或冰浴上，使用完毕后宜立即放置于-20℃保存。

• 大肠杆菌DNA聚合酶I补平双链DNA 5'突出末端(5'overhang)的效果参考图1。
  
  图1.E.coli DNA Polymerase I补平双链DNA 5'突出末端(5'overhang)的效果图。在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或N公司的E.coli DNA Polymerase I，37℃孵育20分钟进行反应，反应完成后75℃孵育20分钟以终止反应。取出5μL反应产物，加入1μL 6×DNA上样缓冲液，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。180V电泳60分钟，之后用Redye红色核酸染料室温染色5分钟，在紫外灯下观察实验结果。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μL):10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl₂,1mM DTT,100μM dNTP Mix,0.5μM dsDNA with 5' overhang (pH7.9@25℃)。dsDNA with 5'overhang (也称具有5'突出末端的双链线性DNA)是使用DNA寡核苷酸退火缓冲液(货号：YT483)并按照该产品说明书推荐的程序，把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'和5'-GTAAAACGACGGCCAGT-3'这两条寡核苷酸链进行退火反应得到的产物，并以此退火产物为底物，进行双链DNA 5'突出末端的补平。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。
  
• 大肠杆菌DNA聚合酶I对3'端带有氨基修饰的双链线性DNA消化(5'→3'外切酶活性)的效果参考图2。
  
  图2.E.coli DNA Polymerase I对3'端带有氨基修饰的双链线性DNA消化(5'→3'外切酶活性)的效果图。在20μL反应体系中加入图中指定量的本制品或N公司的E.coli DNA Polymerase I，37℃孵育20分钟进行反应，反应完成后75℃孵育20分钟以终止反应。取出5μL反应产物，加入1μL 6×DNA上样缓冲液，然后进行15%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳。180V电泳60分钟，之后用Redye红色核酸染料室温染色5分钟，在紫外灯下观察实验结果。如图所示，本制品与N公司的竞品相比，具有类似的催化效果。反应体系(20μL)：10mM Tris-HCl,50mM NaCl,10mM MgCl₂,1mM DTT,0.5μM dsDNA。3'端带有氨基修饰的单链DNA不会被E.coli DNA Polymerase I的3'→5'外切酶活性所降解。3'端带有氨基修饰的dsDNA是使用DNA寡核苷酸退火缓冲液并按照该产品说明书推荐的程序，把5'-ATACATAGATACATAGACTGGCCGTCGTTTTAC-3'NH2和5'-GTAAAACGACGGCCAGTCTATGTATCTATGTAT-3'NH2这两条寡核苷酸链进行退火反应得到的产物，并以此退火产物为底物，进行双链线性DNA消化。实际操作时不同实验条件获得的实验结果会略有差异，图中所示结果仅供参考。

• 双链DNA 5'突出末端(5'overhang)的补平：
  
  • 对于双链DNA 5'突出末端(5' overhang)的补平，参考下表在冰浴中配制反应体系(以20μL体系为例)。
    

    成分	用量	终浓度
    Nuclease-Free Water	(16-x)μL	-
    dsDNA with 5'overhang	xμL	~0.5μM or 5～200ng/μL
    10×Reaction Buffer	2μL	1×
    dNTP Mix (2mM each)	1μL	100μM
    E.coli DNA Polymerase I(10U/μL)	1μL	0.5U/μL
    总体积	20μL	-

    • 在进行末端补平实验时可适当减少酶量，避免在外切酶活性的作用下导致模板的缺失。
      
    • 如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA with 5' overhang之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA with 5' overhang。
      
    • dsDNA with 5' overhang如果是寡核苷酸，最终浓度可以约为0.5μM；如果是消化后的DNA质粒等最终浓度可以约为5～200ng/μL。
  • 按上表设置好反应体系后，适当轻轻混匀反应体系，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
    
  • 反应条件：37℃孵育20分钟。
    注：反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
    
  • 终止反应：75℃孵育20分钟使E.coli DNA Polymerase I失去活性。
• 双链线性DNA的消化：
  
  • 对于双链线性DNA消化，参考下表在冰浴中配制如下反应体系(以20μL体系为例)。
    

    成分	用量	终浓度
    Nuclease-Free Water	(17-x)μL	-
    dsDNA	xμL	~0.5μM or 5～200ng/μL
    10×Reaction Buffer	2μL	1×
    E.coli DNA Polymerase I(10U/μL)	1μL	0.5U/μL
    总体积	20μL	-

    • 如果同时进行多个反应，可以把上表中除dsDNA之外的所有溶液和酶提前混合，分装到各反应管，最后再加入dsDNA。
  • 按上表设置好反应体系后，适当轻轻混匀反应体系，随后低速离心以使粘附在管壁上的液体沉淀至管底。
    
  • 反应条件：37℃孵育20分钟。
    注：反应时间可以根据实际情况酌情适当调节。
    
  • 终止反应：75℃孵育20分钟使E.coli DNA Polymerase I失去活性。
• 其它用途可以参考适当的文献资料进行。

• E.coli DNA Polymerase I能补平3'突出末端吗？
  不能，E.coli DNA Polymerase I只能通过移除3'突出末端的方式形成平末端。
  
• E.coli DNA Polymerase I能补平DNA的5'突出末端吗？
  可以，5'突出末端会被补平，3'突出末端会被削平。Klenow片段缺乏5'→3'外切酶活性，是补平DNA的5'突出末端的首选酶。
  
• E.coli DNA Polymerase I能用于切口平移实验吗？
  能，切口平移实验是该酶的重要应用之一。
  
• 切口平移实验时有温度要求吗？
  切口平移时的孵育温度应低于20℃。在较高的温度下，新合成的链可以分离并被复制。
  
• E.coli DNA Polymerase I可以热失活吗？
  可以。反应结束后添加10mM EDTA螯合Mg²⁺，当温度升高时，可以保护DNA末端，然后在75℃加热20分钟即可将酶灭活。
  
• E.coli DNA Polymerase I能移除5'突出末端吗？
  不能，E.coli DNA Polymerase I的5'→3'外切酶活性仅适用于双链DNA缺刻处。
  
• DNA切口平移能够用来做标记探针吗？
  可以，DNA聚合酶I用5'→3'核酸外切酶去除缺口处的前导碱基，并用标记的碱基填充。该方法适于制作大而均匀的探针，但比活性不高。

相关搜索：大肠杆菌DNA聚合酶I，DNA聚合酶，E.coli DNA Polymerase I